Культивирование мицелия высших базидиальных грибов штамма pS 64 Polyporus squamosus и использование в качестве сырья для производства низкокалорийных пищевых продуктов

Введение

Пищевая промышленность нуждается в пищевом сырье, которое одновременно повышает биологическую и питательную ценность продуктов, улучшает   их технологические характеристики, а также оказывает при регулярном потреблении оздоровительное действие. Огромный потенциал в качестве источников низкокалорийных продуктов питания и пищевых добавок с высоким содержанием белка и биологически активных веществ, представляет глубинный мицелий высших базидиальных грибов. Одним из наиболее перспективного сырья для изготовления продуктов нового поколения являются высшие базидиальные грибы    р.р.Polyporaceae, сочетающие в себе высокие показатели скорости роста, отсутствие токсичности на уровне семейства  (5, 8, 12, 15, 17, 18, 19). Кроме того,   глубинный мицелий высших базидиальных грибов является наиболее приемлемым сырьем для изготовления пищевых добавок, обладающих онкостатическим, гепатопротекторным и иммуномодулирующим действием (1, 2, 6, 13, 22). 

Показано, что сухая биомасса обладает высоким содержанием белка (от 35 до 60 % сырого протеина в зависимости от состава среды и возрастной фазы), с аминокислотным составом, близким к белку сои. Жирнокислотный состав липидов биомассы высших базидиальных грибов данного рода отличается благоприятным для лечебно-профилактического пищевого продукта высоким содержанием эссенциальных ненасыщенных жирных кислот, фосфолипидов, эргостерина (18). Погруженное культивирование мицелия высших базидиальных грибов на углеводсодержащих средах, позволяет ускорить рост биомассы в 8—10 раз, и осуществлять направленный синтез целевых метаболитов, а также использовать типовое оборудование для выращивания грибов разных эколого-трофических групп и стандартизировать получаемые продукты и обеспечить промышленное производство сырья (3, 4, 5, 6, 8, 14, 15). Максимум накопления биомассы до 12% отмечалось при культивировании на углеводсодержащих средах (свекловичная патока) штамма pS 64 Polyporus squamosus (7, 15). На основе этого штамма было организовано небольшое производство пищевого мицелия (5, 15,19).

Необходимость исследований предопределялась   недостаточностью данных по использованию качестве сырья молочной сыворотки, т. е пищевого сырья массового производства и отсутствием исследований по возможности замены мяса в диетах.

Материалы и методы исследований

Экспериментальные исследования по культивированию штамма pS 64 Polyporus squamosus, изучению состава среды, химического состава, биологической ценности, а также острой, подострой токсичности и кумулятивного действия пищевой, испытуемого пищевого сырья и проводились в условиях физиологического двора и лаборатории ПНИИЖиК. Культивирование мицелия   для установления дозировок фосфорных, азотосодержащих и углеводистых добавок (свекловичная патока) выполнялось на лабораторных качалках в емкостях 0,03-0,05 м3. Испытывались семь вариантов органоминерального состава: — контрольная партия — глюкозо-минеральная смесь; опытные партии   (2-7): 2 и 3 сыворотка с водой в соотношении соответственно 1:1 и 1:2; 4 и 5 сыворотка с водой в соотношении 1:1 плюс соответственно 1 и 2 % патоки; -6 и 7 сыворотка с водой в соотношении 1:2 плюс соответственно 1 и 2 %   патоки (n-5). В качестве источника азотистого питания испытаны: (NН4)2 PO4,(NН4)2 PO3, NНPO3, KН NO3   в дозах 0,2-0,3 % азота и 0,1% KН2 PO4 от массы среды Производственные партии мицелия проводили на ферментере емкостью 30м 3 с автоматической системой контроля температуры и рН в условиях Саратовского биохимического завода. Влага определялась высушивания отжатого мицелия в бюксах при 105 С, белковый азот – Берштейну, общий азот по Къельдалю. Для подготовки проб для определения аминокислот использовали кислотный гидролиз в растворе 6 М соляной кислоты, с добавлением норлейцина в качестве внутреннего стандарта. Гидролиз выполняли в термостате при 110°С в течение 24 ч. Для определения цистина и метионина пробы окисляли 50% раствором надмуравьиной кислоты, которую предварительно готовили из муравьиной кислоты и перекиси водорода, с добавлением фенола. Исследование испытуемого сырья на содержание аминокислот методом ВЭЖХ на современном жидкостном хроматографе Prominence-i, LC-2030C 3D Фирма «SHIMADZU CORPORATION», Япония. Состав липидов и жирные кислоты путем газовой хроматографии ГХ, ГЖХ. Определение содержания, моно -, ди -, триглицеридов (метод сравнения) ГОСТ Р. ЕН 14103-2008. Биологическая ценность испытуемых диет определялась на лабораторных животных (белые крысы, n- 30) по методике медико-биологической оценке продуктов питания (21). Испытывались три синтетические диеты, включающие (% по массе):

первая — сухой молочный казеин-75, кукурузный крахмал 15 и сахароза 10 и минеральную подкормку;

вторая — сухие дрожжи -75, кукурузный крахмал 15 и сахароза 10 и минеральную подкормку;

третья — отжатый мицелий -75 (по приведенному к 9 % СВ.), кукурузный крахмал 15 и сахароза 10 и минеральную подкормку.

Производственные партии мицелия проводили на ферментере емкостью 30м 3 с автоматической системой контроля температуры и рН в условиях Саратовского биохимического завода. Биомасса отжималась через фильтр из синтетического материала и замораживалась в камере при температуре минус 18°С.

Переваримость питательных веществ и использование азота, а также оценка биологической ценности отжатого мицелия выполнена в соответствие с методиками ВИЖа (1969) и СЭВ (1998). Полноценность пищевых белков определялась путем сравнения содержания незаменимых аминокислот в испытуемом пищевом сырье, скорректированного с учетом усвояемости и модели потребностей в аминокислотах для детей для детей 2-5 лет по данным ФАО/ВОЗ, 1985(данная возрастная группа имеет наивысшие потребности в белке). Рассчитывались:
– отношение содержания незаменимых аминокислот (НАК) к общему азоту белка (ОАБ) в 100 г белка, выраженное в граммах незаменимых аминокислот на 1 г азота;– количество незаменимых аминокислот в 100 г белка.

—    аминокислотный скор (22), путем сравнения содержания незаменимых аминокислот в испытуемом сырье с продуктом, содержащим стандартный состав: А = НАК1 / НАК2, где А — нескорректированный азотный коэффициент, НАК1 — содержание незаменимых аминокислот в определяемом белке, НАК2 — содержание незаменимых аминокислот в стандартном белке (идеальном).

Проведены совместные медико-биологические и клинические исследования отжатого мицелия препарата в лаборатории Поволжского НИИЖиК биотехнологии с приглашением специалиста из Саратовского Ветеринарного института. Показано отсутствие острой и субхронической токсичности, раздражающего действия на кожные покровы и слизистую оболочку, кумулятивного и аллергенного действия препарата отжатого мицелия. Органолептическую оценку и   проведения органолептической оценки дегустацию котлет проводили по ГОСТ 9959-91 «Продукты мясные. Общие условия».

Для всех количественных данных вычисляли групповое среднее арифметическое (М), стандартную ошибку среднего (SEM) либо среднеквадратичное отклонение (SD). Полученные результаты были обработаны на IBM PC/AT с помощью пакетов прикладных программ Statistica 5.5. Вероятность различий показателей средних в группах определяли с использованием критерия t-стъюдента, Фишера, Различия считали достоверными при уровне значимости р 0,05.

Результаты и их обсуждение

В лабораторных опытах установлены параметры культивирования: температура 26± 2°С, рН-5,8-5,9, расход воздуха- 0,7-1.0 на 1кб. м в мин, число оборотов мешалки-130-150об/мин. Определен состав среды культивирования штамма pS 64 Polyporus squamosus за 24 часа. Наибольший выход биомассы 9-11% за 24часа отмечен при культивировании на средах, содержащих молочную сыворотку в разведении водой 1:1 при добавке и 2,0% свекловичной патоки. Фосфорное питание обеспечивалось добавкой в среду 0,1% KН2 PO4 . Изучение влияния различных азотосодержащих добавок на выход биомассы мицелия.     Примерно равный прирост биомассы равный 10-12% получен   при использовании качестве источника азотисто питания: (NН4)2 PO4. ,(NН4)2 PO3; NН PO3, KН NO3   в дозах 0,2-0,3 % азота от массы среды. При использовании солянокислых солей азота или мочевины прирост биомассы за 24 часа был ниже на 8-12% (р≥ 0,01). Для установления оптимального срока культивирования штамма pS 64 Polyporus squamosus определяли во временные периоды 24, 48 и 72 часа (табл. 1).

                                                                                                               Таблица 1

Влияние продолжительность культивирования на выход биомассы штамма pS 64 Polyporus squamosus

Основной прирост биомассы наблюдался на первые сутки (72%) , далее за вторые, он составил 5 % и в третьи- 3%. Через 48—72 ч в культуре отмечается такой же рост и   утолщение гиф, что указывало на старение культуры, а значит нецелесообразность культивирования более 24 часов. В сравнительных опытах на лабораторных животных проведены исследования биологической ценности мицелия (в сравнение с пищевыми дрожжами и молочным казеином), токсичности и кумулятивного действия. Химический состав и биологическая ценность грибного мицелия приведен в таблице 2.

                                                                                                                        Таблица 2

Химический состав и биологическая ценность   молочного казеина, пищевых дрожжей и мицелия штамма pS 64 Polyporus squamosus (5).

* У белков с высокой биологической ценностью отношение НАК/ОАБ составляет не менее 2,5 ФАО/ВОЗ, 1985

Как показывают данные приведенные в таблице 2, глубинный мицелий отличается от    пищевых дрожжей более высоким содержанием белка, жира, незаменимых аминокислот. Содержание белка в мицелии было выше на    12-15%; лизина в 1,7 раза, метионина на 10% и триптофана на 35%, чем в дрожжах и было сопоставимо с концентрацией аминокислот в молочном казеине.   Мицелий отличается более низким содержанием небелкового азота и нуклеиновых кислот, что указывает на большую полноценность белка в сравнении с пищевыми дрожжами. Соотношение незаменимых аминокислот (НАК1) к общему аминокислотам белка (ОАБ), а также skor    сопоставимо с составом белка молока, что указывает на высокую   пищевую полноценность белка для детского и диетического питания. Эталонное содержание суммы метионина и цистеина г/на 100 г белка 35г., в молочном казенине-34г, дрожжах- 26г и мицелии штамма pS 64 Polyporus squamosus- 32г. Skor метионина и цистеина составил соответственно 0,97; 0,74 и 0,91. Показатели испытуемого образа, указывает на высокую биологическую ценность мицелия штамма pS 64 Polyporus squamosus и предопределяет использование в качестве замены мясного сырья при изготовлении мясосодержащих полуфабрикатов. Состав липидов мицелия высших базидиальных грибов отличается высоким содержанием биологических активных фракций: фосфолипидов и жирных кислот.

 В опытах по испытанию диет наблюдалась высокая адаптационная способность к поеданию диет. Не установлено различий по скорости и полноте их поедания кормов. Потребление сухого вещества в сутки по группам 8- 10 г /гол, азота в сутки по группам 0,32- 0,35 г/гол и обменной энергии-12-14кДж (поддерживающий уровень питания). Установлено, что содержание усвояемого протеина у животных третей группы превышает на 37-41 % этот показатель белых крыс второй группы. Биологическая ценность белка сопоставима с белком молока, а полноценность продута с учетом концентрации и соотношение фосфолипидов и жирных кислот превышает существенно выше. В опытах по определению острой токсичности лабораторные животные (белые крысы и морские свинки) не проявляли агрессии и нервозности.    При вскрытии органы (масса и цвет сердца, печени, почек) были в пределах нормы. В гистологических исследованиях образцов печени белых крыс и свинок опытной и контрольной групп изменений дистрофических и некробиотических изменений не обнаружено. Показано отсутствие острой и субхронической токсичности, раздражающего действия на кожные покровы и слизистую оболочку, кумулятивного и аллергенного действия препарата отжатого мицелия.

В целях установления возможности использования мицелия в качестве   частичной замены мясного компонента в мясных полуфабрикатах. Котлеты изготавливались в соответствие с ГОСТ Р. 51187-98. Для изготовления мясосодержащих полуфабрикатов использовали говядину первой категории по ГОСТ Р. 54315 и мицелий (после 24 часового культивирования на промышленном ферментере), отжатый вручную через   синтетическую ткань. Содержание сухого вещества в говядине составило 34,5% и отжатого мицелия – 38 , 4%. Долю мяса и мицелия для уравнивания основного продукта в массе котлет пересчитывали по сухому веществу: первая-   говядина, вторая — говядина + отжатый мицелий (1:1) и третья-говядина + отжатый мицелий (1: 3). Доля мясного компонента в котлетной массе составляла соответственно 75, 50 и 15% и добавок- 25% . В состав   добавок включались: подсушенный пшеничный хлеб   первого сорта, яйца, лук, поваренная соль,   перец и вода в равных количествах по установленной рецептуре. Изготовление фарша из говядины и отжатого мицелия производилось на электрической мясорубке, другие ингредиенты вводились в период измельчения. Затем из смеси вручную формировались котлеты массой 80-85 г., толщиной 1.8-2,0 см. Котлеты поджаривались на сковороде, на электропечи при температуре 180°С в течение 10 мин

    Органолептические свойства, химический состав и калорийность котлет из говядины и отжатого мицелия представлены в таблице 3.

                                                                                                            Таблица 3

Органолептические свойства, химический состав и калорийность котлет из различных видов сырья

Данные таблицы 3 показывают, что включение в состав рецептов мясных полуфабрикатов отжатого мицелия существенно улучшает качество готового продукта,   роста белкового компонента, снижения концентрации животного жира, увеличения функцонально-активных структурных компонентов пищи. Кроме того, котлеты по калорийности относятся к низкокалорийным продуктам, что важно   для детского и диетического питания.  

Проведена    дегустация котлет говяжьих по ГОСТ 9959-91 (по 9- бальной шкале, Приложение 2).    Котлеты, включающие 50 и 75% отжатый мицелий, признаны более качественными*, чем готовый продукт из говяжьего фарша.

Выводы

1.Параметры культивирования штамма pS 64 Polyporus squamosus pS 64 на глюкозо — минеральной среде: температура 26± 2°С, рН-5,8-5,9, расход воздуха- 0,7-1.0 на 1кб. м в мин, число оборотов мешалки-130-150об/мин.

2.Оптимальный срок культивирования штамма pS 64 Polyporus squamosus на глюкозо — минеральной среде составляет 24 часа.

3. Наибольший выход биомассы при культивировании штамма pS 64 Polyporus squamosus 9-11% за 24часа отмечен при культивировании на средах, содержащих молочную сыворотку в разведении водой 1:1 при добавке и 2,0% свекловичной патоки.

4. Для обеспечения максимального накопления биомассы до 12 % целесообразно использовать в качестве источника азотисто питания: (NН4)2 PO4; (NН4)2 PO3; NН PO3, KН NO3   в дозах 0,2-0,3 % азота от массы среды.

5. Глубинный мицелий штамма pS 64 Polyporus squamosus относится к высокоценным белковым продуктам, обладающим высокой биологической ценностью и усвояемостью. Skor метионина и цистеина (0,91),указывает на высокую биологическую ценность мицелия штамма pS 64 Polyporus squamosus и возможность частичной замены мясного сырья при изготовлении мясосодержащих полуфабрикатов.

6.Глубинный мицелий штамма pS 64 Polyporus squamosus при скармливании его лабораторным животным   не обладают токсическими и кумулятивными свойствами. Дистрофических и некробиотических изменений тканей печени не обнаружено.

7. Включение в состав рецептов мясных полуфабрикатов отжатого мицелия существенно улучшает качество готового продукта за счет    роста белкового компонента, снижения концентрации животного жира, увеличения функцонально-активных структурных компонентов пищи. Котлеты, включающие 50 и 75% отжатого мицелий, по дегустационной оценке (9 -бальная ГОСТ 9959-91) признаны более качественными*, чем готовый продукты из говяжьего фарша.